发酵条件对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖的影响
胡久平，鄢平，戚珊珊，赵辉*
1(西藏月王藏药科技有限公司，西藏拉萨，)2(西藏高原微生物发酵工程技术研究中心，西藏拉萨，)3(拉萨市青稞发酵工程技术研究中心，西藏拉萨，)
摘要：研究了青藏高原环境下高温发酵温度、低温发酵温度、发酵湿度和发酵温湿度的波动性对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响。单因素、正交试验和验证试验表明，发酵条件对青稞红曲中MonacolinK含量影响的主次因素为：高温发酵温度低温发酵温度发酵湿度，最佳发酵条件为高温发酵温度30℃，低温发酵温度为21℃，发酵湿度为60%。以优化的发酵条件进行验证试验，青稞红曲中MonacolinK含量可达1.94%。青稞红曲中β-葡聚糖含量仅与高温发酵阶段红曲的生长情况有关。发酵过程中温湿度波动对青稞红曲中MonacolinK含量有较大影响。
关键词：发酵；青稞红曲；MonacolinK；β-葡聚糖
青稞红曲以青稞为基质经红曲霉发酵而成。红曲霉在发酵过程中能产生MonacolinK(MK)、色素等次级代谢产物，因发酵基质不同还可不同程度地保留发酵基质中的功效成分。ENDO[1]在红曲霉代谢产物中发现了MonacolinK。研究表明，MonacolinK可以有效降低人体内胆固醇水平[2]。他汀类药物是当今药品市场上主要降血脂药物之一，而洛伐他汀作为新型降血脂药因其独特疗效，被誉为治疗心血管系统疾病的里程碑药物。NEWMAN等[3-7]研究表明，β-葡聚糖具有降血脂、降低胆固醇、降血糖、抗运动疲劳等作用。青稞作为世界上麦类作物中β-葡聚糖含量最高的作物，其β-葡聚糖平均含量为6.57%，西藏优良品种藏青25中可达8.6%，是小麦平均含量的50倍。本研究探讨了红曲霉菌以青稞为发酵基质在青藏高原环境下，固态发酵过程中的温度、湿度对MonacolinK和β-葡聚糖的影响，为青藏高原环境下红曲霉菌发酵提供参考。
1材料与方法1.1材料
1.1.1菌种
红曲霉菌(QZGYCG),保藏于青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心。
1.1.2主要仪器和试剂
安捷伦高效液相色谱,安捷伦科技有限公司；DH-A电热恒温光照培养箱,北京科伟兴仪器有限公司；SW-CJ-1F净化工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器，上海三申公司；ZK-82A型真空干燥箱；UV紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。
洛伐他汀标准品，美国Sigma公司；PMMegazyme混联β-葡聚糖检测试剂盒，博欧实德生物技术有限公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、琼脂粉、麦芽糖、酵母膏(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.3培养基
(1)菌种斜面培养基：沙氏琼脂改良培养基(麦芽糖5g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉40g，水mL，pH自然)，自制。
(2)固态发酵培养基：青稞(市售)粉碎成3～4瓣，于拌料机中加50%的水(m/m)，浸泡15min，拌匀，每瓶取g装于mL三角瓶中，于0.1MPa下灭菌20min。
1.2实验方法
1.2.1培养方法
(1)斜面培养：取红曲霉菌点种于斜面培养基上，30℃，避光培养7d。
(2)种子液培养：将点种于茄子瓶斜面中的菌落，以50mL无菌水洗孢，制成终浓度为个/mL的均一悬液。以5%(v/v)接种于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液态培养基中，30℃，r/min，闭光培养3d。
1.2.2发酵温度的影响
青稞红曲发酵分为高温发酵阶段和低温发酵阶段。
(1)高温发酵：将种子液按10%(v/m)接种于灭菌固态发酵培养基中并摇散。分别置于27、30、33、36℃下发酵4d，后转入20℃下发酵10d，整个发酵过程湿度保持在40%，收获发酵产物，于60℃下烘干，粉碎备用。
(2)低温发酵：将种子液按10%(v/m)接种于灭菌固态发酵培养基中并摇散，于33℃下发酵4d后，分别于15、18、21、24℃下发酵10d，整个发酵过程湿度保持在40%，收获发酵产物于60℃下烘干，粉碎备用。
1.2.3发酵湿度的影响
将种子液按10%(v/m)接种于灭菌固态发酵培养基中并摇散。分别置于33℃下发酵4d，转入20℃下发酵10d，整个发酵过程分别在湿度40%、50%、60%、70%下进行，收获发酵产物于60℃下烘干，粉碎备用。
1.2.4发酵条件优化
为筛选出最佳发酵条件组合，根据单因素试验结果，以青稞红曲中MonacolinK为评价指标，对高温发酵温度、低温发酵温度、发酵湿度3个因素进行正交试验，每个因素选择3个水平，按L9(34)正交表设计试验，各个因素水平见表1。
表1配方优化正交试验因素与水平
Table1Factorsandlevelsoforthogonalexperimentsforformulationoptimization
1.2.5温、湿度波动性的影响
(1)温度的波动性试验：将种子液按10%(v/m)接种于灭菌固态发酵培养基中并摇散。于27～35℃下高温发酵4d，后置于15～27℃下低温发酵10d，对照组高温发酵阶段温度保持在33℃，低温阶段发酵温度保持在20℃，整个发酵过程湿度保持在40%，收获发酵产物于60℃下烘干，粉碎备用。
(2)湿度的波动性试验：将种子液按10%(v/m)接种于灭菌固态发酵培养基中并摇散。置于33℃下高温发酵4d，后转入20℃下发酵10d，发酵过程湿度保持在20%～75%，对照组湿度保持在60%，收获发酵产物于60℃下烘干，粉碎备用。
1.2.6青稞红曲中MonacolinK的检测[8]
标准曲线的制作：配制质量浓度为0.1、1、10、30、75、、μg/mL的MonacolinK标准溶液。分析时，用洗脱液平衡分析柱，基线稳定后将不同质量浓度的MonacolinK标准品也进行HPLC分析，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，MonacolinK含量为横坐标作图，线性关系良好，r在0.以上时，进行后续样品测定。
固态发酵样品处理及色谱条件：将青稞红曲粉碎(40目，粉状)并充分混合均匀。准确称取～.0mg试样于50mL容量瓶中。加入30mL75%vol乙醇，摇匀，室温下超声50min。加75%vol乙醇至接近刻度，再超声10min，之后冷却至室温，用75%vol乙醇定容至50mL。以r/min的旋转速度离心10min。取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液待用。色谱柱：C18(5μm，mm×4.6mm)；流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=∶∶0.14；柱温：20～25℃；紫外检测器，波长.0nm。流速：1mL/min；进样量：20μL；样品预处理后经0.45μm滤膜过滤后用HPLC测定。
MonacolinK含量按公式(1)计算：
(1)
式中：X，试样中MonacolinK的含量，mg/g；h1，样品中内酯型洛伐他汀峰面积；h2，样品中酸式洛伐他汀峰面积；c，标准洛伐他汀(内酯)溶液质量浓度，mg/mL;50，试样定容体积，mL;h3，标准洛伐他汀(内酯)溶液峰面积；m，试样称取质量，g。
1.2.7青稞红曲中β-葡聚糖的测定[9]
用研磨机或离心粉碎机将样品粉碎成可通过0.5mm筛网的粉末；精确称量80～mg样品粉末，加入玻璃离心管中(16mm×mm，17mL容量)，轻拍离心管，确保所有的样品都在离心管底部；用0.2mL含水乙醇(50%vol)使样品湿润以利于分散，加磷酸钠缓冲液(4.0mL,20mmol/L,pH6.5),用涡旋混合器搅拌；混合好后，立即将离心管置于沸水浴中孵育60s，用涡旋混合器剧烈搅拌，再次沸水孵育2min，再次搅拌；再次50℃孵育离心管及其内容物，平衡5min；加入地衣聚糖酶(0.2mL,10U)，搅拌内容物，用封口胶密封离心管，50℃孵育1h，期间用涡旋混合器定时剧烈搅拌(3～4次)；加入醋酸钠缓冲液(5.0mL,mmol/L,pH4.0)，用涡旋混合器剧烈混合离心管内容物；将离心管在室温下平衡5min，离心(g,10min)，分别向3个试管(12mL容量)底部小心准确移取0.1mL；将溶于50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)的β-葡聚苷酶(0.1mL,0.2U)加入其中2个试管中(反应)，第3个试管(反应空白)，加50mmol/L醋酸盐缓冲液(0.1mL，pH4.0)，50℃孵育所有试管10min；每管加GOPOD试剂(3.0mL)，再次50℃孵育20min；从水浴中取出试管，在nm下1h内测定吸收光度值。
β-葡聚糖
(2)
式中：ΔA=A处理(反应)后的吸光光度值-A空白；F为吸光光度值转换为葡萄糖质量的因子，F=×D-葡萄糖的质量(μg)/μgD-葡萄糖的吸光光度值；=体积校正(如从30.0mL取0.1mL);1/,从μg转化为mg;/W=一定质量干粉中β-葡聚糖含量以百分比表述的因子，W为样品的干物质质量，mg；/=β-葡聚糖中游离的D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酐的因子。
1.2.8统计分析方法
试验设计和数据皆采用Minitab16.0进行分析处理。
2结果与分析2.1高温发酵阶段温度对MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响
红曲高温发酵阶段主要是红曲霉的生长过程，基本上不代谢产生MonacolinK，但对低温发酵阶段MonacolinK的合成累积有潜在影响(图1)。
图1高温对MonacolinK及β-葡聚糖的影响Fig.1TheeffectsofdifferenthightemperatureonMonacolinKandβ-glucansproduction
由图1可知，在不同高温发酵温度下青稞红曲中MonacolinK含量先升后降，30℃时MonacolinK产量最高，这可能是因为30℃最适红曲霉菌的生长，前期的生长情况对微生物后期次级代谢产物含量有较大影响。β-葡聚糖的含量基本上与MonacolinK含量相反，β-葡聚糖作为一种糖类物质，在红曲霉菌生长过程中会产生相关的酶将其分解利用，所以红曲霉菌的生长情况会直接影响青稞红曲中β-葡聚糖的含量。
2.2低温发酵阶段温度对MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响
低温发酵阶段是青稞红曲中功能物质合成累积的阶段，低温发酵温度对青稞红曲中功能性物质的影响如图2所示。
图2低温对MonacolinK及β-葡聚糖的影响Fig.2TheeffectsofdifferentlowtemperatureonMonacolinKandβ-glucansproduction
由图2可知，当低温发酵温度控制在21℃时，青稞红曲中的MonacolinK含量最高可达1.55%，这是因为低温发酵阶段是青稞红曲次级代谢产物MonacolinK合成累积的阶段，适宜的温度有利于功能性物质的合成累积。各个低温下最终发酵产物中β-葡聚糖含量差别不大，这说明低温发酵过程基本上不消耗β-葡聚糖。
2.3湿度对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响
湿度在红曲发酵过程中对功能性物质的合成累积有重大影响[10]。湿度对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响如图3所示。
图3湿度对MonacolinK及β-葡聚糖的影响Fig.3TheeffectsofhumidityonMonacolinKandβ-glucansproduction
由图3可知，青稞红曲中MonacolinK含量随着发酵湿度的增加而增加，发酵湿度60%和70%间MonacolinK含量增加量不显著(P0.05)。β-葡聚糖含量是随着发酵湿度增加而减少的，且发酵湿度在60%和70%时β-葡聚糖含量存在显著性差异(P0.05)。
2.4发酵条件正交试验优化结果
高温发酵温度、低温发酵温度和发酵湿度是影响青稞红曲产MonacolinK的重要因子，为了确定这3个因素对青稞红曲MonacolinK产量作用大小，进行了正交试验，试验结果见表2。
表2发酵条件优化正交试验结果与分析
Table2Resultsandanalysisoforthogonalexperimentsforfermentationconditionsoptimization
由表2可知，以青稞红曲中MonacolinK含量为评价指标，各因素对青稞红曲中MonacolinK含量的影响程度依次为高温发酵温度低温发酵温度发酵湿度。最佳组合为A2B2C3，即高温发酵温度为30℃，低温发酵温度为21℃，发酵湿度为70%，但是考虑到西藏高原干燥气候条件，发酵湿度在60%基础上调高10%所需能耗，单因素试验结果表明湿度为60%和70%时，青稞红曲中MonacolinK含量间无显著差别(P0.05)，β-葡聚糖含量却存在着显著性差异(P0.05),因此选择发酵湿度为60%，即调整最佳组合为A2B2C2，即高温发酵温度为30℃，低温发酵温度为21℃，发酵湿度为60%。在此优化后的发酵条件下进行验证试验，青稞红曲中的MonacolinK含量可达1.94%。
2.5发酵温度波动性对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响
为考察青稞红曲发酵过程中温度在一定范围内波动对代谢产物含量是否影响，进行发酵温度波动性试验，其结果如图4所示。
图4温度波动情况及对MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响Fig.4TheeffectsoftemperaturefluctuationonMonacolinKandβ-glucansproduction
由图4可知发酵过程在波动性的温度下较恒定温度对青稞红曲中的MonacolinK和β-葡聚糖含量有明显的影响。波动性温度显然不利于MonacolinK合成累积，这可能是因为波动性的温度不利于红曲霉菌在高温发酵阶段的生长；另外红曲霉菌各类次级代谢产物的产生，特定的代谢产物一般对应特定的温度范围，波动性的温度则不利于MonacolinK的合成累积，还有可能会产生一些不期望的代谢物产生。在波动性温度下红曲霉菌的生长情况较恒定温度下的差，而红曲霉菌的生长过程中会分解利用β-葡聚糖，恒定温度情况下红曲霉菌生长更好，从而消耗的β-葡聚糖也会更多。
2.6发酵湿度波动性对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响
红曲发酵需要较高的湿度，发酵过程中的湿度对青稞红曲中的MonacolinK和β-葡聚糖含量有明显影响。湿度的波动性对青稞红曲中MonacolinK和β-葡聚糖含量影响如图5所示。
图5湿度的波动情况及对MonacolinK和β-葡聚糖含量的影响Fig.5TheeffectsofhumidityfluctuationonMonacolinKandβ-glucansproduction
图5表明在恒定湿度下青稞红曲中MonacolinK含量可达1.94%，而在波动的湿度下MonacolinK含量仅为0.32%，这表明湿度的波动性对青稞红曲中MonacolinK含量影响巨大。β-葡聚糖含量在波动湿度情况下较恒定湿度下高，可能是因为恒定湿度下更有利于红曲的生长，从而分解利用更多的β-葡聚糖，红曲生长情况越好其消耗的β-葡聚糖越多，因此恒定湿度下青稞红曲中β-葡聚糖含量较波动性湿度下相对偏低。
3结论青稞红曲是以青藏高原特色农作物青稞为基质经红曲霉菌发酵而成，其不仅可较好保留青稞中的功效成分β-葡聚糖，且可发酵获得较高含量的功能性物质MonacolinK。本研究以青稞红曲中MonacolinK为指标对发酵温度、发酵湿度、发酵温度的波动性、发酵湿度的波动性进行研究。通过单因素试验确定在青藏高原环境下有利于青稞红曲中MonacolinK合成累积的温度分别是高温发酵阶段30℃，低温发酵阶段21℃；发酵湿度为70%。通过正交试验并结合西藏高原干燥的气候条件、发酵成本和功能性物质有效提高量，确定最佳的发酵条件为高温发酵温度30℃，低温发酵温度21℃，发酵湿度60%。在此发酵条件下，青稞红曲中MonacolinK含量可达1.94%，β-葡聚糖含量可达2.30%。本研究表明青稞红曲中β-葡聚糖的含量与红曲在高温发酵阶段生长情况有极为密切的关系，与低温发酵阶段的代谢产物合成累积基本上无关系。因此可通过选择β-葡聚糖高含量的青稞品种作为发酵基质可有效提高青稞红曲中β-葡聚糖的含量，其消耗率和功能性物质的产生率还需进一步研究。通过温、湿度波动性试验，结果表明发酵过程中温、湿度的波动不利于青稞红曲中MonacolinK的合成累积，因此青稞红曲发酵过程控制显得尤为重要。本研究首次对青藏高原环境下青稞红曲发酵产MonacolinK等功能性物质的环境条件进行研究，为青藏高原青稞红曲工业化发酵提供了一定参考。
TheeffectoffermentationconditionsontheproductionofMonacolinKandβ-glucanofhullesbarleyMonascusHUJiu-ping,YANPing,QIShan-shan,ZHAOHui*
1(TibetYuewangTibetanMedicineTechnologyCo.,Ltd.,Lhasa,China)2(MicroorganismfermentationengineeringtechnologyresearchcenteroftheTibetanplateau,Lhasa,China)3(LhasaHullesbarleyFermentationEngineeringTechnologyResearchCenter,Lhasa,China)
ABSTRACT：Theeffectsoffermentationtemperature(highandlowtemperaturephase),humidityandthefluctuationoftemperatureandhumidityonMonacolinKandβ-glucancontentofhullesbarleyMonasusonTibetanplateauwereinvestigated.Theresultsofsinglefactorexperimentandorthogonalexperimentindicatedthattheorderofeffectfromhightolowwastemperaturephase,lowtemperaturephaseandhumidity.Thebestfermentationconditionswerehighfermentationtemperature30℃,lowfermentationtemperature21℃and60%humidity.TheMonacolinKproductioninhullesbarleyMonascuscouldachieve1.94%usingthesefermentationconditions.Thisresearchshowedthattheβ-glucancontentonhullesbarleyMonasucsjusthadrelationshipwiththegrowthofMonascusinhightemperaturefermentphase.ThefluctuationsoftemperatureandhumidityintheprocessoffermentationwouldhavegreatinfluenceonMonacolinKcontentinhullesbarleyMonascus.
Keywords：fermentation;hullesbarleyMonascus;MonacolinK;β-glucan
DOI：10./j.cnki.11-2/ts.
第一作者：硕士研究生(赵辉为通讯作者,E-mail：zhaoh
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